流式細胞術檢測的工作原理

在流式細胞術中使用的儀器稱為流式細胞分析儀，通常縮寫為“細胞分析儀"。流式細胞分析儀由一個用于進行細胞處理的流體系統和一個包括數據采集信號檢測器和處理器的光學系統組成。專為 FACS 設計的儀器還包含一個細胞分選組件，該組件可將細胞引導到不同的捕獲容器中。

流體系統設計用于生成單細胞的均勻流，以確保當細胞被用于檢測的光源照射時，能夠進行適當分析。這通過使用加壓管將細胞從樣品管注入流室中來完成。從容器（通常是一根試管或一塊多孔板）中抽取細胞樣品，并將其注入流動液體（稱為鞘液）層流中間的流室中。通過一個稱為流體動力學聚焦的流程，鞘液可幫助縮窄細胞流，從而將細胞組織成一行大致單行的流線。

流式細胞分析儀的光學系統包括照明源、過濾器、透鏡和收集光學器件。照明源常包括 1 個或多個激光束，且每個激光器發射的光波長不同。檢測器不區分各種光波長，而是通過放置在光路徑中的過濾器來將光限制在所需波長范圍內。

流式細胞術檢測的工作原理：抗體、熒光團和細胞染料的重要性

為了通過流式細胞術分析特定靶標，對細胞組分進行熒光標記。這可以通過使用單獨的熒光分子（例如，細胞染料）或熒光團標記的抗體（直接偶聯抗體或使用偶聯二抗）來完成。

流式細胞術中抗體的使用

抗體是許多生物檢測中的關鍵工具，在流式細胞術中也不例外。抗體具有特異性結合單個蛋白或蛋白修飾的能力，并且可作為一種方法來標記那些用于進行檢測的靶標。通過標記目的靶標，研究人員可以評估各種細胞類型、疾病狀態、治療條件、發育階段或其他生物模型中蛋白的豐度或活性。

與不同蛋白結合的抗體不會相互干擾，因此，可以使用多種抗體同時檢測多個靶標。這稱為多重分析。抗體數量的限制是獨立于其他抗體測定每種抗體的能力。在流式細胞術中，這種差分測定使用稱為熒光團的熒光分子來完成。成功的實驗要求具有高度特異性和經驗證的抗體以及可靠的熒光團。

流式細胞術中熒光團的使用

熒光團的共同特性是能夠發射與用于照亮染料的光相比波長更長的光。例如，如果使用藍色激光器來照亮稱為綠色熒光蛋白 (GFP) 的分子，那么蛋白會吸收藍光并發射綠光。被吸收的光與被發射的光之間的波長差異稱為斯托克斯位移。

就是這種位移讓人們能夠準確定量來自熒光團的光，因為它能夠過濾來自激發源的光的波長。激發源總是比從正在分析的熒光團中發射的熒光更亮些，并且如果這種光無法移除，那么它將會強烈影響檢測器。

熒光染料吸收的光的范圍稱為“激發"光譜，而激發時其發出的熒光稱為“發射"光譜。激發和發射光譜針對所有常見染料提供，并呈曲線顯示各波長下吸收或發射的光量。

流式細胞術中的偶聯抗體：直接與間接熒光團標記

通常，在流式細胞術實驗中用于獲取讀數的熒光團會與抗體共價結合。該過程稱為偶聯，并且該抗體-熒光團配對稱為偶聯物。當在一項細胞檢測中使用偶聯抗體時，熒光團發射的光可作為細胞內或細胞上存在的抗體量的一個直接指標。（由于細胞膜是透光的，細胞內熒光團發射的光不會顯著衰減。）通過使用特異性結合蛋白或蛋白修飾的偶聯物，研究人員可以根據每個細胞發射的熒光水平，直接量化該細胞中的目的靶標。該過程稱為直接檢測或直接流式細胞術。

流式細胞術的直接與間接染色

直接：直接偶聯抗體

• 可直接多重分析來自同一宿主的抗體

• 由于孵育和洗滌步驟更少，因此實驗步驟更快

• 能夠在一項檢測中使用許多不同的抗體，從而能夠同時讀取大量終點

間接：非偶聯一抗 + 偶聯二抗

• 可改善以低豐度存在的靶標的檢測，同時由于二次放大可提供更高的靈敏度（多個二抗結合一個一抗）

• 當直接偶聯物尚未獲得時，有益于一抗的初始驗證

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