凝膠電泳遷移速率的決定因素你知道有哪些么

  　　凝膠電泳遷移速率的決定因素你知道有哪些么

　　瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質，其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場中，在中性pH值下帶負電荷的DNA向陽極遷移，其遷移速率由下列多種因素決定:

　　1、DNA的分子大小

　　線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。

　　2、瓊脂糖濃度

　　一個給定大小的線狀DNA分子，其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對數與凝膠濃度成線性關系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。分離小于0.5kb的DNA片段所需膠濃度是1.2-1.5%，分離大于10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%，DNA片段大小間于兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。

　　3、DNA分子的構象

　　DNA分子處于不同構象時，它在電場中移動距離不僅和分子量有關，還和它本身構象有關。相同分子量的線狀、開環和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動速度是不一樣的，超螺旋DNA移動快，而開環雙鏈DNA移動慢。如在電泳鑒定質粒純度時發現凝膠上有數條DNA帶難以確定是質粒DNA不同構象引起還是因為含有其他DNA引起時，可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個回收，用同一種限制性內切酶分別水解，然后電泳，如在凝膠上出現相同的DNA圖譜，則為同一種DNA。

　　4、電源電壓

　　在低電壓時，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長，片段越大，因場強升高引起的遷移率升高幅度也越大，因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段有效分離所加電壓不得超過5V/cm。

　　5、嵌入染料的存在

　　熒光染料溴化乙啶用于檢測瓊脂糖凝膠中的DNA，染料會嵌入到堆積的堿基對之間并拉長線狀和帶缺口的環狀DNA，使其剛性更強，還會使線狀DNA遷移率降低15%。

　　6、離子強度影響

　　電泳緩沖液的組成及其離子強度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時(如誤用蒸餾水配制凝膠)，電導率小，DNA幾乎不移動，在高離子強度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液)，則電導很高并明顯產熱，嚴重時會引起凝膠熔化或DNA變性。

　　對于天然的雙鏈DNA，常用的幾種電泳緩沖液有TAE[含EDTA(pH8。0)和Tris-乙酸]，TBE(Tris-硼酸和EDTA)，TPE(Tris-磷酸和EDTA)，一般配制成濃縮母液，儲于室溫。